綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)elisa試劑盒說明書

                                  綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)elisa試劑盒說明書

試驗原理：

TRH試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知TRH濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將TRH和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中TRH的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制

96/48人份酶標板 1塊板（96T） 半塊板（48T） 即用型

塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型

標準品：24ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說明書進行稀稀

空白對照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型

標準品稀釋緩沖液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型

生物素標記的抗TRH抗體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

親和鏈酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型

洗滌緩沖液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml） 按說明書進行稀釋

底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

終止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

自備材料

1． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項

1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法

1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備

1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

24 ng/ml （6號標準品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

12 ng/ml （5號標準品） 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

6.0 ng/ml （4號標準品） 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

3.0 ng/ml （3號標準品） 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

1.5 ng/ml （2號標準品） 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0.75 ng/ml （1號標準品） 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0 ng/ml （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟

1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案

標準品濃度（ng/ml）

A 24 24 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

B 12 12 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

C 6.0 6.0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

D 3.0 3.0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

E 1.5 1.5 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

F 0.75 0.75 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限

6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

結 果 判 斷 與 分 析

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的TRH標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的TRH含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3、檢測值范圍：0-24ng/ml

4、敏感度： 0.1 ng/ml