為什么你的elisa檢測結(jié)果不理想？您知道原因所在嗎？

為什么你的elisa檢測結(jié)果不理想？

　　elisa作為經(jīng)典的免疫檢測方法，看起來很平常，然而真正做好它并不容易。有哪些方法可以借鑒呢？我們總結(jié)了幾點：

　　1. 確定您的樣本類型和試劑盒可以兼容

　　常見樣本類型有血清，血漿，細(xì)胞培養(yǎng)上清，如果是**實驗驗證過的，可根據(jù)產(chǎn)品說明購買使用。【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應(yīng)的血漿性質(zhì)存在差異，需單獨確認(rèn)兼容性】。

　　2. 試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標(biāo)志物濃度

　　elisa試劑盒的定量檢測范圍需參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線最低和最高濃度區(qū)間內(nèi)屬于線性范圍，其中的值是可信和可定量的。濃度高于線性范圍的樣品要稀釋到線性范圍內(nèi)來測量，而濃度低于線性范圍的樣品，其測量值不能用于計算濃度，只能用做參考。有一種常見的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標(biāo)志物的濃度偏低，測量值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低值。

　　3. 樣本收集有講究

　　以血清為例，樣本收集可參考試劑盒說明書，但需注意以下要點。樣本盡量用無菌管收集，避免細(xì)菌的酶類和代謝產(chǎn)品對結(jié)果的影響。采集過程要避免溶血，因為紅細(xì)胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會影響檢測。保存過程中如有沉淀，應(yīng)離心后取上清液。樣本若不立即測定，建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃，每次檢測使用一管，即避免交叉污染和反復(fù)凍融，有能保證檢測結(jié)果的平行可比性。

　　4. 實驗前要準(zhǔn)備好相應(yīng)試劑

　　提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境，這個過程大致需半小時左右。洗液是濃縮液，如有結(jié)晶析出，需完全溶解后再進(jìn)行稀釋。A、B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液。為保證蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制質(zhì)量，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，重溶前需將管子離心，加入說明書指定的緩沖液，慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻，至少 15 分鐘，不建議用槍頭吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分裝后根據(jù)說明書要求的溫度保存。梯度稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品時，建議用聚丙烯管（對蛋白吸附力很低），每步都要充分混勻且更換新槍頭，確保梯度準(zhǔn)確性。

　　5. 儀器設(shè)備的準(zhǔn)備也必不可少

　　相關(guān)設(shè)備包括移液器、洗板機(jī)/搖床和酶標(biāo)儀。移液器的準(zhǔn)確性對于ELISA實驗結(jié)果的可靠性十分關(guān)鍵，需要確保定期校準(zhǔn)維護(hù)。搖床的使用是為了讓反應(yīng)體系快速達(dá)到平衡，獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果。不用搖床對實驗通常的影響是，OD 值低，CV 大。酶標(biāo)儀等設(shè)備使用前提前 15 分鐘開機(jī)預(yù)熱。

　　6. 剩余的試劑盒材料要妥善保存

　　標(biāo)準(zhǔn)品分裝后按說明書要求的溫度保存，這樣可以避免污染，對要求冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)品還可以避免反復(fù)凍融；酶標(biāo)板放回錫箔紙袋，加入干燥劑，封緊封口，4℃保存。忌未將酶標(biāo)板完全平衡至室溫，就放回錫箔紙袋，因為此時由于溫度差，酶標(biāo)板上會有水汽，不利于穩(wěn)定保存。

　　7. 預(yù)實驗：通常預(yù)實驗包括全部標(biāo)準(zhǔn)曲線和小量樣本。

　　預(yù)實驗有兩個主要目的，一來是熟悉實驗流程，發(fā)現(xiàn)可能忽略的問題；二來是測試樣本和試劑盒是否匹配，一旦出現(xiàn)不匹配的情況，不至于浪費過多樣本。另外是對樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解，以確定合適稀釋度。

　　8. 孵育時要保證溫度均勻，防止揮發(fā)變干

　　孵育時壓緊封口膜。多塊板一起實驗時，要平放各板，不要疊放，以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應(yīng)。

　9. 加樣要快速準(zhǔn)確，避免氣泡

　　加樣時間宜控制在 15 分鐘內(nèi)。加樣前要將樣本混勻，特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會有分層現(xiàn)象），應(yīng)上下顛倒充分混勻，注意動作輕緩，避免產(chǎn)生氣泡。如凍存融化后的樣本有沉淀，可以再次離心。整個加樣過程都要注意避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會影響蛋白的相互結(jié)合，而影響反應(yīng)進(jìn)行。

　10. 手動洗板的操作指南

　　加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應(yīng)新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的優(yōu)質(zhì)吸水紙。需要用力拍板，使孔內(nèi)沒有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標(biāo)板拍干后立即做后續(xù)的加液。

　　11. 顯色反應(yīng)的關(guān)鍵點

　　elisa試劑盒實驗是個酶促底物顯色反應(yīng)，隨時間增加，顯色變深，所以選擇**時間終止反應(yīng)是得到準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本濃度的重要因素。終止過程要完全。使用的 TMB 底物時完全終止點是黃色，不會有任何程度的藍(lán)色或綠色，終止過程中必要時可以震蕩 96 孔板，或用槍頭抽吸混勻（終止液含強(qiáng)酸，避免腐蝕）。