DH5α感受態(tài)細(xì)胞實驗的關(guān)鍵準(zhǔn)備步驟

DH5α感受態(tài)細(xì)胞實驗的關(guān)鍵準(zhǔn)備步驟后，接下來便是將外源DNA導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的核心操作過程。

首先，從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰上融化，此過程需避免反復(fù)凍融，以保持細(xì)胞的活性。同時，將待轉(zhuǎn)化的DNA（如質(zhì)粒）輕柔混勻，并取適量（一般不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10）加入到感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕輕吹打幾次混勻，注意動作要輕柔，以免損傷細(xì)胞。

隨后，將混合液在冰上靜置30分鐘，讓DNA充分吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面。此期間，可預(yù)熱不含抗生素的LB培養(yǎng)基至室溫，為后續(xù)的復(fù)蘇步驟做準(zhǔn)備。

時間到后，將感受態(tài)細(xì)胞-DNA混合物置于42℃水浴中熱激90秒，然后迅速轉(zhuǎn)移回冰上冷卻2-3分鐘。這一步是轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵，通過溫度的急劇變化促使細(xì)胞攝取外源DNA。

最后，向冷卻后的混合物中加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，體積約為原始感受態(tài)細(xì)胞體積的5-10倍，然后置于37℃搖床中，以200-250rpm的速度振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)胞恢復(fù)生長并表達(dá)質(zhì)粒上的抗生素抗性基因。

經(jīng)過這一系列的精細(xì)操作，DH5α感受態(tài)細(xì)胞已成功導(dǎo)入了外源DNA，接下來的步驟將是通過涂布平板或液體篩選等方法，挑選出成功轉(zhuǎn)化的菌落，進(jìn)行后續(xù)的鑒定與分析。