細胞內ELISA實驗方案

細胞內ELISA（也稱為基于細胞的ELISA、細胞蛋白質印跡或細胞印跡）是一種使用比色或熒光讀數對培養細胞進行定量的廣為接受的免疫細胞化學測定方法，用于量化培養細胞中的靶蛋白或靶蛋白的翻譯后修飾。

     這里我們提供了96孔微孔板的通用方案。大致流程包括：培養細胞（根據需要進行處理）并將其接種到包被的96孔微孔板中；固定和透化后，將一抗添加到孔中并孵育，然后添加標記的二抗，最后進行檢測和分析。

一、準備細胞

     粘附細胞可以在推薦的分析微孔板中生長，或直接接種到分析微孔板中并允許其附著貼壁幾個小時或過夜。

所需材料

     - 96孔微孔板：底部透明

（續寫內容）

二、固定與透化處理

固定步驟需在細胞貼壁完成后進行。建議使用4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，隨后用PBS輕柔洗滌3次。透化處理可選用0.1% Triton X-100或0.5% Tween-20溶液，作用5分鐘以增加細胞膜通透性，便于抗體滲透。注意透化時間過長可能導致蛋白流失，需根據目標蛋白的亞細胞定位優化條件。

三、抗體孵育與信號放大

1.封閉：每孔加入200 μL含5% BSA的PBS，室溫封閉1小時，減少非特異性結合。

2. 一抗孵育：稀釋一抗于封閉液中（建議參考抗體說明書優化濃度），每孔加入100 μL，4℃過夜或室溫孵育2小時。若檢測磷酸化蛋白，需在裂解緩沖液中添加磷酸酶抑制劑。

3. 二抗標記：洗滌后加入HRP或熒光標記的二抗（避光操作），室溫孵育1小時。為增強信號，可選用生物素-鏈霉親和素放大系統。

四、檢測與數據分析

1. 比色法：加入TMB底物顯色10分鐘，2M H?SO?終止反應，450 nm波長讀取吸光度。

2. 熒光法：若使用熒光二抗，直接通過酶標儀檢測對應波長（如FITC: 488/520 nm）。

3. 標準化：建議同時設置β-actin或GAPDH內參孔，數據以目標蛋白/內參比值呈現。

注意事項

- 細胞密度需控制在70%-90%匯合，過高易導致信號飽和。

- 每步洗滌需徹底（3×5分鐘），避免殘留試劑干擾。

- 對于弱表達蛋白，可延長一抗孵育時間或提高二抗靈敏度。