避免抗體實驗誤差解析五大常見問題有哪些

一、抗體選擇與驗證問題

?特異性不足?：需明確目標蛋白的亞型、修飾狀態及識別表位，優先選擇經過WB驗證的抗體（如CST、Abcam等品牌），并查閱獨立文獻驗證。

?種屬匹配錯誤?：確保抗體說明書標注的種屬反應性與實驗樣本一致（如人、小鼠等）。

二、樣本處理與保存問題

?樣本降解?：組織樣本需及時固定（離體2小時內），裂解液需含蛋白酶/磷酸酶抑制劑，避免反復凍融。

?定量偏差?：采用BCA法或Bradford法時需注意去污劑干擾，建議分裝保存以減少凍融影響。

三、實驗操作優化

?抗體濃度與孵育?：避免盲目提高濃度，需通過預實驗優化稀釋比例（如WB常用1:1000），4℃過夜孵育可增強特異性結合。

?封閉不充分?：更換封閉液品牌（如BSA或脫脂牛奶）或延長封閉時間，降低非特異性結合。

四、信號檢測與背景控制

?高背景?：檢查二抗濃度是否過高，優化洗滌條件（如增加洗滌次數或調整沖擊力）。

?條帶模糊/缺失?：驗證轉膜條件（電流、時間）及抗體效價，使用陽性對照確認蛋白表達。

五、抗體保存與使用誤區

?反復凍融?：分裝保存（建議≥10μL/管），避免效價降低；即用型抗體需4℃保存，長期不用建議-80℃。

?回收利用風險?：稀釋后抗體緩沖體系易變化，推薦現配現用，尤其對效價敏感的抗體。

通過嚴格遵循上述步驟，可顯著降低抗體實驗誤差，提高結果可靠性。