12-HETE Elisa Kit原理：

ELISA試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將待測物質和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質的濃度呈比例關系。

12-HETE Elisa Kit 組成：

自備材料

1）蒸餾水。

2）加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3）振蕩器及磁力攪拌器等。

12-HETE Elisa Kit 標本要求

1.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2.不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2.操作步驟

1.編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照 2 孔、陽性對照2 孔、空白對照 1

孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）

2.加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照 50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，

3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同 3。

8.洗滌：操作同 5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘.

10.終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。

12-HETE Elisa Kit 數據計算

1. 繪制標準曲線：各標準品 OD 值減去底色即減去空白孔 OD 值，以 6 個標準

品的 OD 值為縱坐標 y，以標準品的濃度為橫坐標 x，繪制曲線圖，如圖示，

并計算出回歸方程 y=ax+b。

2. 將待測樣品的 OD 值代入方程式，計算各組樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即

為樣品的實際 ABP 濃度。

3. 敏感度：1.0 pg/ml

注意事項：

1. 實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2. 加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免**孔與最后一孔間的時間間隔過大，否則將會導致不同的預孵育時間，從而影響

實驗的準確性以及重復性。

3. 孵育：嚴格按照說明書上規定的孵育時間和溫度進行。

4. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。

5. 建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高，應對樣品進行稀釋，計算結果時乘以相應的稀釋倍數。

6. 建議使用本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線，試用幾個標本），如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經銷商聯系，

如果因運輸過程導致試劑盒失效，可要求調換，但概不承擔產品本身以外的任何損失。

12-HETE Elisa Kit安全性

1． 避免人體直接接觸顯色劑A、B和終止液。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要進食、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：2-8℃

2.有效期：6個月