牛棒桿菌探針法熒光定量PCR 試劑盒
【產品名稱】牛棒桿菌探針法熒光定量PCR 試劑盒
Name ：Corynebacterium Bovis Probe qPCR Kit
【包裝規格】50次/盒
【預期用途】牛棒狀桿菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒狀桿菌屬(Corynebacterium spp.)的某些細菌引起的膀胱炎和腎盂腎炎。臨床主要特征為頻尿、濁尿、血尿和發熱。該病主要見于成年母牛，多在妊娠期和產后發病。本病分布于世界各地。因此快速靈敏檢測牛棒桿菌具有重要意義。本產品就是為此目的根據 PCR 原理開發的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據牛棒桿菌高度保守區設計，不會跟其他細菌的 DNA 發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
【規格及成分】
成分 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色蓋） |
熒光PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
牛棒桿菌探針法qPCR 引物混 合液 | 100 μL（白蓋） |
牛棒桿菌qPCR 探針 | 50 μL（棕色管） |
牛棒桿菌探針法qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
使用手冊 | 1份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品DNA。
【使用方法】一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，**用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，**設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式細菌DNAout。本試劑盒免費贈送 20次免DNA 提取的核酸釋放劑，本產品的裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略 了 DNA 提取步驟。
三、、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分/每管 | 樣品管 N+2 個 | RT-PCR 陰性對照 | 標準曲線樣品管 （1-6 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
牛棒桿菌 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
牛棒桿菌探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
N+2 個待測 DNA 模板 | 7 μL | - | - |
超純水 | - | 7 μL | - |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） | - | - | 各 7 μL（2 號樣到2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
11.蓋上蓋子后上機，按面參數進行 RT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反應 （40 個循環） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec（采集 FAM 通道的熒光信號） |
四、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
